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技术 | 蛋白纯化(三)

发布时间:2020-02-05 17:32 |  点击次数:

为了能够有效的、经济的获取足够纯度和质量的某种蛋白质,使用有效的纯化方法,从样品的制备到富集蛋白,从提取样品为了获取样品的生物化学特性到大规模生产治疗性重组蛋白都是有必要的。设定目标蛋白要求达到的纯度和产量的目标,维持生物活性和以钱和时间方式来衡量的纯 化过程的经济性,是非常重要的。对纯度的要求必须要考虑原料的性质,最终产品的预期使用 目的和特殊的安全问题。例如,区分必须要去除的杂质和可以包含的杂质是非常重要的。 

其它因素也能影响物质的优先次序。高产量通常是关键目标,但是对于样品很容易获得或者需求量很小的产物,追求高产量就不是那么关键了。在缺少ÄKTA™设计色谱系统资源的条件下,要求多方面纯化方法的进展或许是不可能的。同样,时间压力与一个缓慢的分析流程相结合,将会引导蛋白质纯化朝向更少的监测和最优化的组合方向发展。所有涉及到靶蛋白特性和污染物的信息在纯化方法研究过程中都将会有帮助作用,使选择更快、更容易的纯化技术和优化纯化条件成为可能,同时可以避免那些可能使靶蛋白失活的因素。随着蛋白纯化方法和评价纯化效果(产量、生物活性,回收率)的进展,研制快速和可以信赖的分析方法已经成为必需。

明确目标

01

按照对产品的最终使用来规定产品纯度要求

对于不同需求,有不同的纯度要求。

02

明确“关键”杂质并尽快的鉴定杂质特性

样本的种属来源需要和抗体的种属来源不同。像western blot这样的实验应用,样本是没有内源性免疫球蛋白(IgG)的细胞裂解液,或者使用直标一抗的实验应用,都不用担心这个问题。

如果不得不需要使用和样本种属来源相同的抗体 (如鼠抗鼠的抗体),建议进行抗体定制服务。

03

保证产物优于所需纯度

尽管纯化步骤数应该最少化,但是最终产物的质量不能打折扣。如果纯化产物的纯度低并且污染物是未知的,随后的一系列研究结果的可信性将会受到怀疑。

那些能够使蛋白降解或者失活或者干扰分析结果的污染物应该尽可能早的去除。在整个纯化进展过程中,在纯化的每一个阶段都必须考虑维持蛋白活性的需要。如果在纯化的第一步蛋白酶就被除去,将靶蛋白转移到一个友好温和的环境中是特别有益的。

下游的生产过程是在限定的经济框架里完成的,用安全的和可以信赖的方法完成靶蛋白的纯化,达到需要的纯度和回收率。经济是一个非常复杂的问题。在商业化生产中,时间对于市场来说是非常重要的,它能够弱化一些问题,对纯化方法进行有效的组合,使回收率、容量或者速度三者达到最佳的组合。产品的稳定性和可靠性同样受到很大的关注,因为一个批次产品的失败会产生很多严重的后果。

生物制药方面的纯化或许涉及到一些特殊的安全问题,例如检测和去除病原体、热原、免疫原等污染物和致癌的危害物质。用分析技术锁定特殊的污染物质为了证明它们已经被降低到可以接受的水平是必须的。

分析测定

01

选择快速和可以信赖的分析方法

为了在纯化方法的研究中取得有效的进展,应该评价每一步纯化的效果 。实验室应该使用下列 分析方法 :

• 针对靶蛋白的快速和可以信赖的分析方法。

• 确定纯度。

• 确定总蛋白量。

• 针对那些必须被去除的杂质的分析。

样品制备是否优先于第一个色谱纯化步骤取决于样品的类型。在一些情况下可以将样品直接用 于第一步步骤,即样品捕获。例如,细胞培养上清可以直接用适宜的色谱基质例如Sepharose™ Fast Flow进行纯化,可能仅仅需要一个小的pH值的调整或者离子强度调整。然而,对于一些样 品,提取和澄清步骤是最基本的。如果样品需要进行提取,那么所选择的技术必须是稳定的和 适用于将来可能用到的所有规模的纯化。我们必须注意到,某种技术例如硫酸铵沉淀法,经常 用于小规模的纯化,可能不适用于非常大规模的样品制备。如果一个纯化方法将要用于扩大规 模生产,缓冲液和添加剂的选择必须要仔细考虑。在这些例子中,便宜的缓冲液,例如在实验 室常用的醋酸缓冲液或者柠檬酸缓冲液,较适用于更复杂的组分。同样我们也应该注意到透析 和其它用来调整样品状态的通用方法不适用于非常大量的或者非常小量的样品准备。

对于重复性纯化,使用一种稳定的和能够处理样品差异的提取和澄清技术。这样可以确 保在下一次的纯化步骤中得到同一个重复性的产物,不管是否与开始物质具有差异性。

只有在必要的时候才使用添加剂来保证样品的稳定性或者提高样品的提取效果。选择那 些容易被去除的添加剂。添加剂可能需要通过额外的步骤去除。

使用 Sephadex™ G-25凝胶过滤介质预装柱,应用于实验室规模的快速的样品净化,如表2所示: