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技术 | 蛋白纯化(二)

发布时间:2020-02-05 17:28 |  点击次数:

随着样品的背景信息、分析方法和样品的制备和提取步骤的进展,可以应用三步纯化策略对样 品进行纯化。(下图) 这个策略被用来帮助发展制药工业中治疗性蛋白的纯化过程,同时在帮助研 究性实验室研制纯化方案时也是同样有效。

目标分配

01

分配一个特定目标物到每一步

在三步纯化策略中,一个特定目标物被分配到每一步中。纯化问题与特定的步骤相关联,在很大程度上取决于起始物质的特性。因此,一个纯化步骤的目标物将依据它在纯化过程的位置而不同,即在开始阶段,将产物从粗制样品中分离时,在中间纯化阶段,为了进一步纯化已经部分纯化的样品时,或者在最后阶段将纯化好的样品进行净化处理。三步纯化策略保证更快的纯化方法进展和用更短的时间和更经济的方式纯化产品。在捕获阶段,将目标物进行分离、浓缩并且对目标物进行稳定化处理。目标物被浓缩和转移到另外一个环境中,可以保存它的活性或效价。最终,其它关键污染物被大量的去除。在中度纯化阶段,制品中的大量杂质已被去除, 例如其它的一些蛋白质和核酸、内毒素和病毒。在样品精细纯化阶段,由于大量的杂质已经被去除,仅剩下一些痕量的杂质或者是与目标物非常接近的相关物质。制品完成了最终的纯化。应该注意的是三步纯化策略并不意味着所有的纯化策略都必须经过三个纯化步骤。例如,对靶蛋白的捕获和中度纯化可能在一个纯化步骤中就完成了,或许中度纯化和最后的精致可能在一个纯化步骤中就完成了。类似的,如果对纯度的要求很低时,一个快速的捕获步骤就足够获得想要得到的结果,或者制品开始的纯度就很高,只要经过精细纯化阶段就可以达到需要的纯度的产品。对于治疗性蛋白的纯化,或许需要四阶段纯化或者五阶段纯化步骤才能够完全达到对 纯度和安全性的最高要求。对于一个有效的纯化过程,捕获、中度纯化和精细纯化阶段的优化组合是非常关键的。

02

纯化技术的选择和组合

样品处理最小化 

纯化步骤最少化 

在每一步骤中使用不同的技术

 

对于色谱分离技术而言,考虑到回收率、分辨率、速度和容量等因素,每种不同的色谱技术将会得到不同的绩效表现。一种色谱技术可能对于上述参数的其中之一是最优的,例如分辨率或者在两种参数间获得最佳的平衡,例如速度和容量。对于按照这些参数其中之一进行优化的分离纯化方法所产生的结果,与那些使用同样的技术但是聚焦于一个可选择参数所产生的结果有显著不同。离子交换技术既可以用于捕获阶段也可以用于样品的精细纯化阶段。

 

选择一种技术满足纯化步骤所要求达到的目标

 

捕获, 用简单的模式表示,参考在纯化过程中加载靶蛋白的总量。在一些情况下,加载样品的总量或许会受到上样体积的限制(如在凝胶过滤色谱中)或者受到大量存在于样品中的污染物的限制,而不是靶蛋白的总量的限制。

 

速度,在开始纯化阶段速度是一个最重要的环节,需要尽可能快的将样品中的污染物如蛋白酶等必须去除的物质除去。

回收率 在整个纯化的进程中,回收率的重要性会逐渐增加,因为被纯化产品的价值在逐渐增加。回收率受到对样品破坏过程的影响和不适宜色谱柱条件的影响。

分辨率 高分辨率的获得是通过对色谱技术的选择和色谱介质的效率来形成一个很窄的色谱峰。一般情况下,在样品纯化的最后阶段获得好的分辨率是非常困难的,因为这时样品中的杂质和靶蛋白质的特性非常相似。每一种技术在分辨率、速度、容量和回收率等参数中都达到了一种平衡,在样品纯化中,我们可以选择这些技术来满足对每一个纯化步骤的要求。一般来说,如果使上述4个参数中的一个参数最优化,那么将会以损失其它3个纯化参数为代价并且纯化步骤也会受到影响。

 

每一个纯化参数的重要性是变化的,这主要取决于一个纯化步骤是否用于捕获、中度纯化或者精细纯化阶段。这将指导关键参数的最优化,同样也指导在每一步纯化中选择最适宜的介质。应用色谱技术对蛋白质进行纯化,这些色谱技术的分离作用是根据样品与杂质在某些特性方面的不同而进行分离的。

凝胶色谱技术能够很好的适用于那些经过浓缩技术(离子交换、疏水层析、亲和层析)处理过的样品,因为目标蛋白经过洗脱后体积缩小,来自洗脱缓冲液中的复合组分不会对凝胶过滤分离产生影响。(凝胶过滤是一个限定体积容量和不受缓冲液条件影响的非结合技术)。最终纯化策略的选择总是取决于样品的特殊特性和需要达到的纯化程度。下图所示的是各种纯化技术的合理组合。

03

标准纯化策略

使用一个组合的纯化技术和选择其中之一的纯化技术对样品进行纯化。对于样品而言,在一个离子交换—疏水层析—凝胶过滤层析三步纯化策略中,捕获阶段的选择根据电荷的差异(在离子交换中)、中度纯化阶段根据疏水性的差异和最后的精细纯化阶段根据蛋白质大小的差异进行纯化的。下图所示的是一个标准的三步纯化策略

样品条件

尽管我们要尽量避免在两步纯化之间对样品进行额外的处理,但是对一个已经洗脱样品的缓冲 液进行调节(pH、离子强度和/或缓冲离子对)或许是必要的,这样可以保证样品液与随后所使用的纯化技术具有兼容性。Sephadex G-25是一个用于在两步纯化之间通过缓冲液交换进行快速 脱盐和调节pH值的理想介质。加载的样品体积可以高达总柱体积的30%,或者在一些情况下达到总柱体积的40%。在一个单一的纯化步骤中,样品被脱盐,交换到一个新的缓冲液中,并且 低分子量的物质被去除。图7所示的是一个典型的脱盐/缓冲液交换分离。高体积容量和速度使 得这一步能够快速和有效的处理非常大的样品体积。加载高样品体积可以使在分离过程中对样品的稀释最小化。Sephadex G-25在实验室规模的制备中也被用于快速样品净化。

01

对介质的考虑

Sephadex G-25 凝胶过滤法

在高分子量和低分子量物质之间进行快速的组分分离

典型的流速为60 cm/h (Sephadex G-25 Superfine, Sephadex G-25 Fine), 150 cm/h (Sephadex G-25 介质).

在下面的捕获章节、中度纯化章节和精细纯化章节中会进行更加详细的讨论。

注释: 

cm/h: 流速(线性流速) = 流过的体积/柱子的横断面积