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技术 | 蛋白纯化(一)

发布时间:2020-02-05 17:17 |  点击次数:

蛋白质纯化技术和方法的进展一直是推动生物技术进步的最基本的前提条件。

蛋白质纯化方式多种多样,从简单的一步沉淀操作到 大规模的有效的生产过程。对蛋白质进行成功有效的纯化的关键是选择最适宜的纯化技术,优化它们的操作过程来满足所要求达到的纯度,并且将它们以合适的方式组合起来,使用最少的纯化步骤达到蛋白质产量的最大化。大部分的纯化方案都包含一些色谱技术。因此作为研究结果,色谱技术在那些需要进行蛋白纯化的实验室里已经成为了一个基本的工具。不同的色谱技术有不同的选择性,它们可以形成强大的组合来纯化任何活质分子。

重组DNA技术的发展使蛋白质的产量得到很大的提高。重组蛋白的制备经常以方便后续的色谱纯化的形式存在。然而,这仍然不能解决所有的问题。宿主污染问题仍然存在,与样品的可溶性,蛋白结构的完整性和生物活性等的相关问题仍然存在。尽管在纯化过程中可能需要考虑大量的参数,但是按照一些简单的指导原则和应用三步纯化策略,仅仅需要了解一些色谱技术基础知识的细节,就可以使整个纯化过程能够简单容易的设计 和完成。

 

01

方案的制定

 

确定纯化方式

首先要制定基本的纯化方案。一般需要考虑回答的问题,例如:

制备产品的目的是什么?什么样的原材料是可以使用的和如何处理它?纯度问题与材料的来源有什么样的关系,和终产品的预期使用有什么联系?什么东西必须去除?什么东西必须完全去除?最终纯化的规模是什么?如果需要扩大规模,用已选择的纯化技术将会产生什么样的后果?在经济方面的限制是什么?什么样的资源和设备是可以利用的?

 

纯化步骤的制定?

多数纯化需要经过一步以上的方法来达到预期想要的产品纯度。这包括任何需要改变样品条件的限制性步骤,即将产品从一种纯化技术转移到另一种适合于进行下一步纯化操作的状 态,这一过程中的每一步都将会导致产物的丢失。

例如,假定每一步能够获得80%的产量,那么经过8个纯化步骤后,总产率将被减少到仅仅20%。因此,使用最少的步骤和最简单可行的设计来达到预期的产量和纯度,增加步骤是无效的,除非已经完全满足了纯化所需 要达到的产量。在某些特殊的情况下,通过简单的增加重复步骤就可以很容易使样品达到可以 使用的纯度。但是经验表明,即使是那些最具挑战性的样品纯化,高纯度和高产量的制品也是 可以通过恰当的选择并有效的组合少于四步的纯化步骤高效率的完成。各种技术应该以逻辑的 顺序组合起来,避免改变样品条件的步骤,恰当的选择色谱技术使纯化步骤尽可能的少。

 

02

样品的制备

 

为了高效、经济的获取足够纯度和数量的蛋白,我们可以使用每一种纯化方法。设定纯化物的纯度、数量和维持生物活性和限定经济的框架和工作时间框架是非常重要的。所有涉及到目标蛋白的特性和污染物的信息都会对纯化的进展有所帮助的。用一些简单的实验来反映样品和目标分子的特性是一个非常好的方式。随着纯化技术的进展和评价纯化效果的需要,发展快速的 和值得信赖的分析方法是最非常重要的。样品的制备和提取过程的发展应该优先于使用色谱技 术进行第一步纯化。在有样品背景信息的情况下,分析样品和样品制备步骤可以放在三步纯化策略中考虑。

 

三步纯化策略

想象纯化样品要经历三个阶段,样品捕获,中度纯化和样品的精细纯化。

在三步纯化策略中特定的目标物在纯化过程中的每一步都要进行分配。

在目标物捕获阶段,样品经过分离、浓缩并且对目标物进行稳定化处理。

在中度纯化阶段,样品中大量杂质被去除,例如其它的蛋白和核酸、内毒素和病毒。

在样品精细纯化阶段,通过去除任何残留的微量杂质或者密切相关的物质来达到较高的纯度。

选择和优化组合纯化技术对于样品的捕获、中度纯化和样品的精细纯化是非常关键的,确保快 速纯化方法的研制,在更短的时间里完成产物的纯化并且实现经济节约的目标

01

明确目标

 

对于纯化样品,明确最终产品需要达到的纯度、活性和产量要求,要避免过度纯化或者使用的 纯化不够,达不到要求的纯度。

 

明确需要纯化的目标蛋白质的特性和关键的杂质 对纯化技术的选择要简单化,并且要产生最佳的纯化效果。

 

运用合理的检测分析技术能够快速的检测蛋白质的活性/回收率和关键的污染物。

02

保持简单化

使每一阶段处理的样品最小化 避免过多的处理步骤,过多的处理步骤有可能会损失样品活性/降低回收率。

尽可能少地使用添加剂 可能需要额外的纯化步骤去除添加剂,否则添加剂可能会干扰样品的活性分析。

尽早去除对样品有损伤的杂质 例如,蛋白酶

在每一步纯化过程中使用不同的纯化技术 充分利用样品的特性对样品进行分离纯化(样品大小、电荷、疏水性、配基的特异性)

使用的纯化步骤尽可能少 额外的纯化步骤将会减少目标蛋白的产量和增加纯化时间,要合乎逻辑的组合纯化步骤。