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如何对包涵体蛋白进行表达与复性

发布时间:2022-01-19 11:09 |  点击次数:

关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈,包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。

一、包涵体蛋白的表达

在平板上挑取单菌落,接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中,37 ℃过夜培养,然后转接到100 ml LB 培养基中,37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时,加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。8000 r/min 离心5 min 收集菌体,加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl,冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。

二、包涵体的洗涤
在包涵体中加入包涵体洗涤液:50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl,w=0.5%TritonX-100,pH 8.0;37℃振荡洗涤1~2 h,然后8 000 r/min 离心15 min,收集沉淀。

三、包涵体的溶解
洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液):6 mol/L 尿素,50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L  EDTA,50mmol/L NaCl,10 mmol/L β-ME,pH 8.0(注:β-ME用时现加),于磁力搅拌器上搅拌过夜,1000  r/min离心30 min,取上清即得包涵体溶解液。

四、包涵体的复性
包涵体的复性目前常用的主要有两种方式:1,稀释溶液,但是操作的液体量大,蛋白稀释;2,透析,超滤或电渗透析去除变性剂。

1.包涵体的稀释复性
设定不同的复性条件:蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等,使变性溶解的包涵体稀释复性,复性一定时间后取样测酶活性。

2.包涵体的透析复性
包涵体蛋白的复性将8 mol/L 尿素溶解后的样品装入透析袋,密封置于复性液I(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;5%甘油;5 μmol/L EDTA;pH8.5),4 ℃ 透析12 h 后再转入复性液II(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;)4 ℃ 透析12 h,12000 r/min 离心30 min,收集上清进行蛋白浓度及活性测定。